常见问题 | 原因 | 建议 |
细胞无法标记 | 确保所有的抗体都按照厂商的说明书正确存储。 |
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确保商品化抗体没有超过有效期。 |
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确保已正确加入足量的抗体。 |
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确保抗体已连接荧光素。如果未连接荧光素，需加入连接有荧光素的二抗。 |
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确保二抗是好的，也就是说二抗曾经能与另外的一抗成功结合。 |
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确保使用了正确的二抗，就是说二抗能够识别你的一抗。如果使用的是PE或APC荧光素的抗体，确保该抗体未被冰冻过。 |
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确保使用正确的激光来激发荧光素，并使用了正确的通道来检测该荧光。 |
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PE抗体无法标记， 而FITC抗体的结果却很好 | PE荧光素可能冰冻过 | 如果冰冻过，建议另外买一管新的抗体。 |
多聚甲醛（PFA）可能会导致此问题 | PFA 降解后可释放出甲醇，从而影响染色。所以切记PFA尽可能新鲜配制，或者细胞尽可能不要固定，染完色就立即检测。 |
非特异性染色
| 非特异性染色可能是由于自发荧光 | 用一管只加细胞不加抗体的空白管，查看细胞自发荧光水平。 某些细胞可表达低亲和力的Fc受体CD16/CD32，这种受体可通过Fc片段结合大多数抗体。对于小鼠细胞，可使用SeroBlock FcR阻断该位点。 |
非特异性染色也可能是由于二抗引起 | 选择一种只与一抗反应、却不会与检测组织发生交叉反应的二抗。确保洗涤充分。 |
小心滴定抗体 | 降低抗体浓度可减少非特异性染色。 |
荧光强度弱 | 荧光弱可能是由于抗体过度稀释 | 因此使用前通过正确滴定抗体，以确保抗体浓度适当。 |
荧光弱可能由于细胞数量过多 | 正确调整细胞密度，一般低于1×10E7/ml。 |
如果查阅到该抗原确实本身表达弱，那么建议选择更亮的荧光素 |
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荧光弱可能是由于抗原本身就表达低，可通过查阅文献，明确抗原表达水平 |
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在交叉反应明显的抗体中，其荧光强度弱于特异性高的单克隆抗体 |
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一抗或二抗的孵育时间和温度均需优化 |
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确保细胞是新鲜收集的，否则容易出现大量死细胞和碎片 |
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对细胞进行刺激、活化时，可影响细胞散射光特性 |
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如果要裂解红细胞，确保裂解液新鲜配制并且配制正确 |
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结果与预期的相反 | 有些试剂可能会影响某些抗原检测，例如EDTA可影响一些血小板标记的检测。 |
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裂解液也可以影响一些抗原检测，此时可采用PBMC提取法试试 |
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有些抗原是表达在胞内的，故需选择正确的破膜剂进行正确的破膜处理 |
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